蜘蛛侠（彼得·帕克）： 本作主角，拥有超强的敏捷、力量与蛛丝能力，可在城市中自由摆荡并打击罪犯。他的战衣具备多种战斗模式，适合快速突袭和灵活作战。
毒液： 外星共生体附身宿主形成的强大反派，攻击方式包括触手缠绕和酸液喷射，具有极高的破坏力和再生能力，是蜘蛛侠的主要敌人之一。
绿魔： 装备高科技滑翔翼和南瓜炸弹的疯狂反派，擅长空中突袭和爆炸攻击，战斗风格狡诈多变，对蜘蛛侠构成巨大威胁。
电王： 能操控电流的超级反派，释放高压电击和电磁脉冲，近战与远程攻击兼备，需小心其范围性技能。
猎人克莱文： 精通狩猎技巧的强力反派，使用弓箭、陷阱和近战武器，战斗风格诡谲难测，擅长利用环境伏击对手。
章鱼博士： 机械触手赋予他极强的近战能力，可抓取投掷物体或直接攻击，战斗时需注意其范围控制和爆发伤害。
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